Diagnóstico por PCR- RFLP
Este es un medio de diagnosticar si hay una mutación en el ADN de alguna proteína que ocasiona problemas, ya sea una enfermedad o una mejora frente a alguna característica productiva. Pare eso debe hacerse primero una PCR y una vez amplificado el ADN hay que digerirlo o cortarlo con una enzima de restricción.
¿Por que detectan mutaciones estas enzimas de restricción? porque como reconocen una secuencia específica de 6 o 4 pares de bases, al aparecer una mutación se puede perder el que era un sitio de corte para una enzima o al revés se puede generar un sitio de corte en el ADN.
Si podemos amplificar por PCR un segmento o porción de un gen, y luego le agregamos una enzima de restricción puede que se produzcan fragmentos, si en el ADN amplificado hay una o varias de esas combinaciones de 6 o 4 pares de bases. Quizás al comparar el gen normal con el mutado, se haya perdido o ganado un sitio de restricción para alguna de las miles de enzimas de restricción conocidas
Ejemplos de dos tipos de enzimas de restricción.
Algunas de las miles de enzimas conocidas son:
| Nombre | Fuente | Sitio de reconocimiento |
|---|---|---|
| EcoRI | Escherichia coli | 5 ′ − GAATTC − 3 ′ 3 ′ − CTTAAG − 3 ′ |
| BamHI | Bacillus amyloliquefaciens | 5 ′ − GGATCC − 3 ′ 3 ′ − CCTAGG − 3 ′ |
| HindIII | Haemophilus influenzae | 5 ′ − AAGCTT − 3 3 ′ − TTCGAA − 5 ′ |
| SmaI | Serratia marcescens | 5 ′ − CCCGGG − 3 3 ′ − |
. FuenteA modo de ejemplo y usando la imagen de arriba, si por una mutación de la secuencia que reconoce BamHI, en vez de CCTAGG se cambia a CTTAGG, en ese segmento de ADN se pierde el sitio de corte de BamHI porque deja de reconocerlo y no corta. De modo que en un alelo normal, la enzima BamHI corta, por ejemplo generando dos fragmentos pero en el alelo mutado ya no corta, con lo que veríamos en un gel, solo un fragmento. (puede verse graficado abajo)
Esta técnica puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de un gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.
Un esquema se muestra para ver en que se basa el diagnóstico de PCR-RFLP
Esquema detección de alelos mutados. original de JPH Cor 2004, modificado por Gabriela Iglesias